Benjamin Marie soutiendra sa thèse le mercredi 14 mai 2008 à 14 heures dans l’amphithéâtre Gutenberg.

Titre : Évolution des biominéralisations nacrées chez les mollusques : caractérisation moléculaire des matrices coquillières du céphalopode nautiloïde Nautilus macromphalus et du bivalve paléohétérodonte Unio pictorum

Résumé

Chez les métazoaires, la coquille des mollusques constitue un objet d’étude de référence pour comprendre les phénomènes de formation des biominéralisations carbonatées. La coquille, sécrétée par l’épithélium minéralisant du manteau, est constituée à plus de 95% de carbonate de calcium – calcite et/ou aragonite, et de moins de 5% d’une matrice organique composée de protéines, de glycoprotéines et de polysaccharides. Cette matrice calcifiante est directement impliquée dans les processus de formation du biominéral.
Ce travail de thèse consiste en l’étude de la matrice organique associée à la couche nacrée. Chez les mollusques, la nacre est présente dans les coquilles de certains représentants actuels des bivalves, des gastéropodes, des céphalopodes, mais aussi des monoplacophores. La très grande majorité des données publiées sur les constituants macromoléculaires des matrices associées à la nacre concerne exclusivement les genres Pinctada et Pinna pour les bivalves, et le genre Haliotis pour les gastéropodes. Ce travail met en œuvre une approche comparative de ces composés à travers la caractérisation biochimique des matrices de deux nouveaux modèles. Nous considérons que cette approche comparative nous permettra de proposer de nouvelles hypothèses quant aux mécanismes de formation de la nacre, mais également quant à l’évolution de ces constituants organiques au sein des mollusques nacriers.

Le premier modèle étudié est le mollusque d’eau douce Unio pictorum, un bivalve à coquille nacro-prismatique très commun des cours d’eau bourguignons. La matrice organique acido-soluble extraite de la couche nacrée présente une activité enzymatique de type anhydrase carbonique, une enzyme essentielle aux processus de calcification, déjà observée par ailleurs chez Pinctada sp. Des électrophorèses réalisées en conditions dénaturantes sur cette matrice acido-soluble montrent la présence de cinq protéines majoritaires de masses moléculaires apparentes 95, 50, 29, 16 et 12 kDa. L’étude de la glycosylation de ces protéines nous a montré que les protéines de masses moléculaires 95, 50 et 29 kDa, étaient des glycoprotéines fortement glycosylées et que leurs ramifications saccharidiques étaient directement impliquées dans les processus de minéralisation. Notamment, la glycoprotéine de 95 kDa, spécifique de la couche nacrée, porte une quantité remarquable de sucres sulfatés qui sont impliqués dans sa capacité à lier les ions Ca²⁺ ou à interagir avec la précipitation du CaCO₃ in vitro. Des séquences partielles internes ont pu être obtenues pour les différentes protéines de la matrice acido-soluble de la nacre grâce à des analyses par spectrométrie de masse. Le second modèle est le céphalopode Nautilus macromphalus dont la coquille nacro-prismatique est entièrement composée d’aragonite. Des électrophorèses de la matrice acido-soluble ont montré qu’elle est composée de polysaccharides de haut poids moléculaire, de glycoprotéines migrant aux alentours de 60-50 kDa et de 3-4 protéines de masses moléculaires apparentes comprises entre 20 et 10 kDa, capables de lier le calcium in vitro. Sur gel d’électrophorèse à deux dimensions, les différents constituants organiques de la matrice acido-soluble migrent soit à des valeurs de pI très acides (inférieur ou égal à 3 unités), soit à des pI très basiques (supérieur à 9), alors que chez les autres mollusques non céphalopodes, les protéines de nacre sont faiblement acides ou neutres. Des séquences partielles de ces protéines ont été obtenues par séquençage de novo à partir de protéines purifiées par électrophorèses 2-D et de matrice complète analysées par spectrométrie de masse après digestion trypsique. Les nouvelles séquences observées présentent des similitudes avec des protéines de nacre décrites chez les bivalves Pteriomorphia, mais aucune homologie n’a pu être détectée avec les protéines décrites chez les gastéropodes.

Nous avons également décrit, dans une étude préliminaire, les matrices acido-solubles extraites des coquilles de brachiopodes Rhynchonelliformea. Ce travail montre que, chez ce groupe externe aux mollusques, les mécanismes moléculaires de calcification impliquent également la production d’une matrice calcifiante composée de macromolécules aux propriétés biochimiques diverses.

Mots-clés

Biominéralisation, mollusque, nacre, matrice organique, biochimie, glycosylation, spectrométrie de masse, évolution, Unio pictorum, Nautilus macromphalus

Membres du jury 

J.-M. Lebel, professeur, université de Caen – rapporteur
C. Milet, maître de conférences, muséum national d’histoire naturelle – rapporteur
D. Allemand, professeur, université de Nice – examinateur
Pascal Neige, professeur, université de Bourgogne – examinateur
Gilles Luquet, maître de conférences, université de Bourgogne – directeur de thèse
Frédéric Marin, chargé de recherches CNRS, université de Bourgogne – codirecteur de thèse

Abstract
In metazoan, molluscan shells are one of the most fascinating examples for the investigation of the calcium carbonate biomineralization phenomenon. These exoskeletons are secreted by the outer epithelium of the calcifying mantle. They are composed of 95% of mineral – calcite and/or aragonite -, the rest of the shells being constituted by a mixture of proteins, glycoproteins and polysaccharides, called the organic matrix. This calcifying matrix is directly involved in biomineralization.
This PhD work is focussed on the characterization of organic components associated to the nacreous layer. In molluscs, the nacre is observed in shells of extent species of bivalves, gastropods, cephalopods and also monoplacophorans. Most of the published data on macromolecular compounds of the nacre matrices are based on few species belonging to the genera Pinctada and Pinna for bivalves, and to the genus Haliotis for gastropods. In this study, we investigated the characterization of these compounds in two new models, the freshwater mussel Unio pictorum and the cephalopod Nautilus macromphalus. We think that this comparative approach highlights the molecular mechanisms of nacre formation and their evolutionary story within nacreous shell molluscs.
Unio pictorum is a freshwater bivalve, very common in Burgundy, which exhibits a nacro-prismatic shell exclusively composed of aragonite. Its nacre-associated organic matrix exhibits a remarkable carbonic anhydrase activity, a key enzyme in calcification processes, which had already been detected in the shell of Pinctada sp. SDS-PAGE run under denaturing conditions shows that the acido-soluble nacre matrix is mainly composed of 5 discrete proteins of 95, 50, 29, 16 and 12 kDa apparent molecular weight. A glycosylation study shows that the three heaviest components are substantially glycosylated proteins bearing acidic residues, which are directly involved in mineralization processes. Notably, the 95-kDa protein, which is specific of the nacreous layer, carries sulfated sugars implicated in calcium-binding activity and in the capacity to interact with in vitro CaCO₃ crystal precipitation. Partial internal sequences of the nacre-associated proteins were described with mass spectrometry approach.

The nacro-prismatic shell of the cephalopod Nautilus macromphalus is fully aragonitic. SDS-PAGE shows that the acido-soluble matrix is composed of high molecular weight polysaccharides, 63- and 57-kDa glycoproteins and 3-4 calcium-binding proteins migrating between 20 and 10 kDa. On 2-DE, the different components of the nacre matrix migrate either at very acidic or at very basic pI. Partial sequences were obtained by mass spectrometry analysis from purified proteins and complete acido-soluble and acido-insoluble matrix after tryptic digestion. The new sequences exhibit partial similarities with bivalvian nacre proteins, but no homology was detected with gastropod nacre proteins.

Furthermore, we performed a preliminary study of acido-soluble matrices from Rhynchonelliformean brachiopod shells. This work shows that in this phylum the mechanisms of shell formation involve the production of a shell-associated calcifying matrix, which is composed of discrete macromolecular compounds exhibiting various biochemical properties.

Keywords

Biomineralization, mollusk, nacre, organic matrix, evolution, biochemistry, glycosylation, mass spectrometry, Unio pictorum, Nautilus macromphalus, brachiopodes

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Benjamin Marie soutiendra sa thèse le mercredi 14 mai 2008 à 14 heures dans l'amphithéâtre Gutenberg.

Titre : Évolution des biominéralisations nacrées chez les mollusques : caractérisation moléculaire des matrices coquillières du céphalopode nautiloïde Nautilus macromphalus et du bivalve paléohétérodonte Unio pictorum

 

Résumé

Chez les métazoaires, la coquille des mollusques constitue un objet d'étude de référence pour comprendre les phénomènes de formation des biominéralisations carbonatées. La coquille, sécrétée par l'épithélium minéralisant du manteau, est constituée à plus de 95% de carbonate de calcium - calcite et/ou aragonite, et de moins de 5% d’une matrice organique composée de protéines, de glycoprotéines et de polysaccharides. Cette matrice calcifiante est directement impliquée dans les processus de formation du biominéral.
Ce travail de thèse consiste en l’étude de la matrice organique associée à la couche nacrée. Chez les mollusques, la nacre est présente dans les coquilles de certains représentants actuels des bivalves, des gastéropodes, des céphalopodes, mais aussi des monoplacophores. La très grande majorité des données publiées sur les constituants macromoléculaires des matrices associées à la nacre concerne exclusivement les genres Pinctada et Pinna pour les bivalves, et le genre Haliotis pour les gastéropodes. Ce travail met en œuvre une approche comparative de ces composés à travers la caractérisation biochimique des matrices de deux nouveaux modèles. Nous considérons que cette approche comparative nous permettra de proposer de nouvelles hypothèses quant aux mécanismes de formation de la nacre, mais également quant à l’évolution de ces constituants organiques au sein des mollusques nacriers.

Le premier modèle étudié est le mollusque d'eau douce Unio pictorum, un bivalve à coquille nacro-prismatique très commun des cours d'eau bourguignons. La matrice organique acido-soluble extraite de la couche nacrée présente une activité enzymatique de type anhydrase carbonique, une enzyme essentielle aux processus de calcification, déjà observée par ailleurs chez Pinctada sp. Des électrophorèses réalisées en conditions dénaturantes sur cette matrice acido-soluble montrent la présence de cinq protéines majoritaires de masses moléculaires apparentes 95, 50, 29, 16 et 12 kDa. L'étude de la glycosylation de ces protéines nous a montré que les protéines de masses moléculaires 95, 50 et 29 kDa, étaient des glycoprotéines fortement glycosylées et que leurs ramifications saccharidiques étaient directement impliquées dans les processus de minéralisation. Notamment, la glycoprotéine de 95 kDa, spécifique de la couche nacrée, porte une quantité remarquable de sucres sulfatés qui sont impliqués dans sa capacité à lier les ions Ca²⁺ ou à interagir avec la précipitation du CaCO₃ in vitro. Des séquences partielles internes ont pu être obtenues pour les différentes protéines de la matrice acido-soluble de la nacre grâce à des analyses par spectrométrie de masse. Le second modèle est le céphalopode Nautilus macromphalus dont la coquille nacro-prismatique est entièrement composée d'aragonite. Des électrophorèses de la matrice acido-soluble ont montré qu’elle est composée de polysaccharides de haut poids moléculaire, de glycoprotéines migrant aux alentours de 60-50 kDa et de 3-4 protéines de masses moléculaires apparentes comprises entre 20 et 10 kDa, capables de lier le calcium in vitro. Sur gel d’électrophorèse à deux dimensions, les différents constituants organiques de la matrice acido-soluble migrent soit à des valeurs de pI très acides (inférieur ou égal à 3 unités), soit à des pI très basiques (supérieur à 9), alors que chez les autres mollusques non céphalopodes, les protéines de nacre sont faiblement acides ou neutres. Des séquences partielles de ces protéines ont été obtenues par séquençage de novo à partir de protéines purifiées par électrophorèses 2-D et de matrice complète analysées par spectrométrie de masse après digestion trypsique. Les nouvelles séquences observées présentent des similitudes avec des protéines de nacre décrites chez les bivalves Pteriomorphia, mais aucune homologie n’a pu être détectée avec les protéines décrites chez les gastéropodes.

Nous avons également décrit, dans une étude préliminaire, les matrices acido-solubles extraites des coquilles de brachiopodes Rhynchonelliformea. Ce travail montre que, chez ce groupe externe aux mollusques, les mécanismes moléculaires de calcification impliquent également la production d’une matrice calcifiante composée de macromolécules aux propriétés biochimiques diverses.

Mots-clés

Biominéralisation, mollusque, nacre, matrice organique, biochimie, glycosylation, spectrométrie de masse, évolution, Unio pictorum, Nautilus macromphalus

Membres du jury 

J.-M. Lebel, professeur, université de Caen - rapporteur
C. Milet, maître de conférences, muséum national d’histoire naturelle - rapporteur
D. Allemand, professeur, université de Nice - examinateur
Pascal Neige, professeur, université de Bourgogne - examinateur
Gilles Luquet, maître de conférences, université de Bourgogne - directeur de thèse
Frédéric Marin, chargé de recherches CNRS, université de Bourgogne - codirecteur de thèse

Abstract
In metazoan, molluscan shells are one of the most fascinating examples for the investigation of the calcium carbonate biomineralization phenomenon. These exoskeletons are secreted by the outer epithelium of the calcifying mantle. They are composed of 95% of mineral – calcite and/or aragonite -, the rest of the shells being constituted by a mixture of proteins, glycoproteins and polysaccharides, called the organic matrix. This calcifying matrix is directly involved in biomineralization.
This PhD work is focussed on the characterization of organic components associated to the nacreous layer. In molluscs, the nacre is observed in shells of extent species of bivalves, gastropods, cephalopods and also monoplacophorans. Most of the published data on macromolecular compounds of the nacre matrices are based on few species belonging to the genera Pinctada and Pinna for bivalves, and to the genus Haliotis for gastropods. In this study, we investigated the characterization of these compounds in two new models, the freshwater mussel Unio pictorum and the cephalopod Nautilus macromphalus. We think that this comparative approach highlights the molecular mechanisms of nacre formation and their evolutionary story within nacreous shell molluscs.
Unio pictorum is a freshwater bivalve, very common in Burgundy, which exhibits a nacro-prismatic shell exclusively composed of aragonite. Its nacre-associated organic matrix exhibits a remarkable carbonic anhydrase activity, a key enzyme in calcification processes, which had already been detected in the shell of Pinctada sp. SDS-PAGE run under denaturing conditions shows that the acido-soluble nacre matrix is mainly composed of 5 discrete proteins of 95, 50, 29, 16 and 12 kDa apparent molecular weight. A glycosylation study shows that the three heaviest components are substantially glycosylated proteins bearing acidic residues, which are directly involved in mineralization processes. Notably, the 95-kDa protein, which is specific of the nacreous layer, carries sulfated sugars implicated in calcium-binding activity and in the capacity to interact with in vitro CaCO₃ crystal precipitation. Partial internal sequences of the nacre-associated proteins were described with mass spectrometry approach.

The nacro-prismatic shell of the cephalopod Nautilus macromphalus is fully aragonitic. SDS-PAGE shows that the acido-soluble matrix is composed of high molecular weight polysaccharides, 63- and 57-kDa glycoproteins and 3-4 calcium-binding proteins migrating between 20 and 10 kDa. On 2-DE, the different components of the nacre matrix migrate either at very acidic or at very basic pI. Partial sequences were obtained by mass spectrometry analysis from purified proteins and complete acido-soluble and acido-insoluble matrix after tryptic digestion. The new sequences exhibit partial similarities with bivalvian nacre proteins, but no homology was detected with gastropod nacre proteins.

Furthermore, we performed a preliminary study of acido-soluble matrices from Rhynchonelliformean brachiopod shells. This work shows that in this phylum the mechanisms of shell formation involve the production of a shell-associated calcifying matrix, which is composed of discrete macromolecular compounds exhibiting various biochemical properties.

Keywords

Biomineralization, mollusk, nacre, organic matrix, evolution, biochemistry, glycosylation, mass spectrometry, Unio pictorum, Nautilus macromphalus, brachiopodes